cermo-lit.ru

  

Bästa artiklarna:

  
Main / Vad står rfp för i biologi

Vad står RFP för i biologi

Röda fluorescerande proteiner RFP har dykt upp som värdefulla biologiska markörer för biomolekylbildning i levande system. Att utveckla konstgjorda fluorogena system som efterliknar RFP är fortfarande en oförmögen utmaning. Här beskriver vi utformningen och syntesen av sex nya kromoforer som är analoga med kromoforerna i RFP.

Teoretiska beräkningar och molekylära dynamiska simuleringar avslöjar att DNA G4 kraftigt begränsar strålningsfri deaktivering av kromoforer inducerad av en tvinnad intramolekylär laddningsöverföring TICT. Dessa DNA-efterlikningar av RFP uppvisar attraktiva fotofysiska egenskaper som är jämförbara med eller överlägsna naturliga RFP, inklusive högt kvantutbyte, stora Stokes-skift, utmärkta anti-fotoblekande egenskaper och tvåfotonsfluorescens.

Dessutom är dessa RFP-kromoforanaloger en ny och distinkt typ av topologiselektiv G4-sond som är specifik för parallell G4-konformation. Med hjälp av cancerspecifika cellmembranbiomarkörer som mål har långsiktig realtidsövervakning i enstaka levande celler och tvåfotons fluorescensavbildning i vävnadsavsnitt uppnåtts utan behov av genetisk kodning. Gröna fluorescerande proteiner GFP är viktiga verktyg i biomedicinska och farmakologiska studier på grund av deras genetiska kodningsegenskaper och inneboende höga fluorescenskvantutbyten 1-3.

När de smälts samman med proteiner av intresse kan de användas som en fluorescerande markör som är lämplig för att visualisera proteinlokalisering och biokemisk handel med levande celler 4. Röda fluorescerande proteiner RFP har hittills fått mer uppmärksamhet än GFP eftersom de är oumbärliga komplement till FP spektral palett och har ett antal fördelar inom bioavbildning.

RFP: er uppvisar fluorescensemissionsmaxima över 570 nm, så de har mindre autofluorescensstörningar hos celler, lägre ljusspridning och lägre fototoxicitet 5. Dessa gör RFP: er särskilt värdefulla för djupvävnad och helkroppsavbildning.

Att utveckla syntetiska material som efterliknar naturliga fluorescerande proteiner är avgörande för att belysa FP: s foto-fysiska mekanism och skapa nya utsläppskänsliga material och biosensorer.

Tyvärr är de flesta syntetiska kromoforer av RFP icke-fluorescerande liknande denaturerad RFP, på grund av ultrasnabb intramolekylär vibration 7, 8. Att utveckla mycket emissiva molekylära efterlikningar av RFP är fortfarande utmanande.

Med tanke på betydelsen av RFP i in vivo-avbildning begränsar bristen på fluorescerande RFP-efterliknande den tillgängliga spektrala regionen av syntetiska FP-efterliknande material och deras användning i flerfärgad eller djupvävnadsavbildning. De inkluderar: Denna signifikanta upptäckt antydde potentialen för G-quadruplex som ett lovande strukturmotiv för konstruktion av fluorogena GFP-efterlikningar.

Flera viktiga frågor behöver dock fortfarande behandlas: Här rapporterar vi designen och syntesen av en uppsättning nya flerfärgade kromoforer som liknar RFP-kromoforerna Schema 1.

G-quadruplex är en alternativ sekundär nukleinsyrastruktur som bildas av guaninrika G-rika DNA-sekvenser. Det är värt att notera att de G4-begränsade RFP-kromoforerna uppvisar unik tvåfotonsfluorescens och har ett löfte för levande systembild.

Både en-foton och två-foton fluorescerande avbildning av cancerspecifika cellmembranbiomarkörer, såsom proteintyrosinkinas-7 PTK7, har uppnåtts i en levande cell- och vävnadsinställning utan att genetisk kodning krävs.

Kromoforer framhävs i rött. B Kemiska strukturer för kromoforer i RFP. C Strukturer av RFP-kromoforanaloger syntetiserade i denna studie.

D Syntetisk väg för RFP-kromoforanaloger med användning av följande reagens och betingelser: Om inte annat anges köptes alla organiska reagens från kommersiella leverantörer och användes utan ytterligare rening. Ultrarent vatten 18. Föreningar visualiserades med UV-ljus vid 254 nm och 365 nm. Flash-kolonnkromatografi utfördes med användning av kiselgel från Merck 200-300 mesh. Oligonukleotider löstes i buffertlösning 25 mM Tris och pH 8.

Före CD-mätningen glödgades oligonukleotiderna ut efter ovannämnda förhållanden före mätningarna. Absorptionsspektra från 400 nm till 700 nm uppmättes efter inkubering vid RT i 20 minuter.

Under denna process övervakade fluorescensintensiteten vid 606 nm med en exciteringsvåglängd på 513 nm på fluorescensspektrometern. Se stödinformation SI för de experimentella detaljerna för mätning av tvärsnitt med två foton, p K a-mätningar, kvantavkastningsberäkningar, dissociationskonstantmätningar, fotoblekningsanalys, molekylär modellering, DFT-beräkningar, cellodling, cytotoxicitetsmätningar, konstruktion av plasmider och realtids kvantitativ omvänd transkription PCR, flödescytometri och konfokal laserskanning mikroskopi analys, vävnadsavbildning.

Liknande resultat observerades också för andra G4-bildande sekvenser Kompletterande tabell S3. Följaktligen är konventionella G4-strukturer ensamma, utan några andra ytterligare specifika kontakter som finns i spenat, inte effektiva för bindning av GFP-kromoforer och fluorescerande aktivering. A Absorptionsspektra och Q. C-strukturer för RFP-kromoforanalogerna. Bilden är en montage som erhållits under identiska bildupptagningsförhållanden. Vi förutsåg att RFP-kromoforerna, särskilt Kaede-liknande kromoforer Schema 1B, med ytterligare aromatisk ring konjugerad med HBI-kärna skulle leda till två önskvärda funktioner: Detta överensstämmer med deras relativa höga p K a dissociationskonstanten för fenolisk OH-grupp som är 8 .

Kompletterande figur S2 visar att kromoforerna i 0. Detta indikerar att deras fenolatformer är mer relevanta för att härma RFP, vilket är i överensstämmelse med naturliga kromoforer i RFP och andra syntetiska sådana 6, 29. För att erhålla G4-kromoforkomplex med röd emission jämförbar med RFPs, vi försökte ytterligare justera spektroskopisk rödförskjutning av kromoforer genom att införa elektronuttagande substituenter till fenolringen för att underlätta dess deprotonering vid neutralt pH.

För att bestämma huruvida DNA-RFP-efterlikningarna skulle kunna moduleras spektralt av de olika kromoforerna genererades ytterligare fyra nya RFP-kromoforer genom att antingen introducera elektrondonerande metoxyl eller dimetylamino eller elektronavdragande grupper fluor till den ytterligare aromatiska ringen eller avlånga olefiniska kopplingsfiguren 1C.

När de binds till NG16 uppvisade dessa föreningar signifikant ökad fluorescens med emissionsmaxima som sträckte sig från 583 till 668 nm. Figur 1D - G, som spänner över spektrumet från rött till långrött, nästan överlappar hela befintlig RFP-palett.

En panel av DNA-efterliknande av RFP med olika kromoforer tillåter direkt jämförelse av spektrala egenskaper och motsvarande substituenteffekt Tabell 1. Alla syntetiserade kromoforer fluorescerar svagt i vattenlösning vid pH 8 med kvantutbyten under 0. Kvantutbytet för dessa RFP-kromoforer är relativt högre än de för GFP-kromoforer, delvis på grund av den skrymmande aromatiska gruppen, kan hindra den exocykliska C-C-bindningsrotationen, och en liknande effekt observerades också för den syntetiska Kaede-kromoforen 32.

Detta bekräftas av de signifikant ökade livstiden för upphetsat tillstånd för alla G4-kromofor-komplex jämfört med enskilda RFP-kromoforer. Kompletterande figur S4. Det är ännu bättre än för de flesta av RFP med liknande utsläppsmaxima 600—620 nm, såsom mRuby 0. Intressant, införande av dimetylaminosubstituent DFHBASI, en stark elektrondonerande grupp, på bensenringen orsakar en betydande rödförskjutning i båda excitation 35 nm och emission 30 nm som till och med är överlägsen den naftaleninnehållande kromoforen DFHBNI, vilket ändrar fluorescensen från röd till långröd.

Två orsaker kan redogöra för detta fenomen: Som ett resultat, till skillnad från de fasta spektrala egenskaperna hos varje RFP, kan utsläpp av DNA-RFP-efterlikningar enkelt moduleras på ett kontrollerbart sätt genom att ändra olika syntetiska kromoforer som har stor potential att rationellt utformas. En annan spektralegenskap i de nya RFP-efterlikningarna är deras stora Stokes-skift. Ett större Stokes-skift kan minska självsläcknings- och fluorescensdetekteringsfelen orsakade av exciterings-back-spridningseffekter, vilket är fördelaktigt för fluorescerande bild med hög kontrast 38.

Det stora Stokes-skiftet beror troligen på den upphetsade tillståndsavslappningen av RFP-kromoforen själv 39. Dessutom bestämdes också fotostabiliteten för G4-baserade RFP-härmar. Detta resultat föreslog att DNA-RFP-efterliknar har mycket bättre fotostabilitet mot fotoblekning än RFP, vilket troligen är resultatet av det partiella utbytet av bunden kromofor med fri kromofor i lösning förhindrar ackumulering av fotoblekta komplex 24, 40, 41. Två fotonfluoroforer, som samarbetar med tvåfoton-exciteringsfluorescens-TPEF-mikroskopi, har flera fördelar jämfört med konventionell enfotonavbildning, inklusive ökad vävnadsgenomträngning, reducerad oskärpa fotoskador, försumbar bakgrundsfluorescens och hög tredimensionell upplösning 42.

Så vitt vi vet är tvåfotonegenskaperna hos syntetiska RFP-kromoforanaloger helt okända. Dess TPEF-spektrum har en maximal emissionstopp vid 579 nm, vilket är något hypsochromically förskjutit i förhållande till dess en-fotonemissionstopp 583 nm.

Betydligt är att S 0 till S n-övergången för dessa RFP härmar vid cirka 750 nm perfekt matchar avstämningsområdet för femtosekund Ti: Så vitt vi vet är de föreslagna RFP-kromoforerna strukturellt olikt alla strukturella byggnadsställningar av kända G4-ligander eller fluorogener och presenterar en ny kategori av G4 fluorescerande sonder.

Med tanke på att G4 har fått stort intresse på grund av deras ökande biologiska betydelse och tillämpningar inom biosensing, supramolekylär kemi och bionanoteknik 44-46, är utvecklingen av småmolekylära ligander med fluorogen förmåga mycket viktigt för G4-strukturundersökning och G4-riktad läkemedelsupptäckt 47 - 51.

Således motiverar igenkänningsegenskaperna för dessa föreningar med G-fyrdubbla ytterligare undersökning. Alla andra RFP-analoger har lika lågt Kd-värde som sträcker sig från 1. G4s-vikningstopologierna beror på sekvenser, loopgeometri och den lokala miljön, särskilt de centrala metalljonerna i G4s 53.

Det är anmärkningsvärt att under det tillstånd utan metalljoner är den parallella G4-strukturen hos NG16 dåligt bildad, medan tillsats av DFHBFSI avsevärt förbättrar den parallella G4-bildningen, vilket återspeglas av en markant förbättring av deras CD-karaktäristoppar Figur 3C, vilket indikerar dess roll som G4-inducerare.

Dessa CD-resultat bevisar också det avgörande inflytandet av metalljoner på G4-topologi och G4-kromofor-interaktion Kompletterande figur S9. Detta överensstämmer med fluorescensoptimeringsdata som presenteras ovan kompletterande figur S5. Bland de kända G4-sonderna är det bara ett fåtal molekyler som har selektivitet för G4 över duplex-DNA och ännu färre är selektiva för en viss G4-struktur 47 - 51, 54, 55. Ett dosresponssexperiment visade att G-quadruplex NG16 fortfarande kan detekteras vid 0.

C Vändbar topologisk växling mellan parallella och antiparallella G-fyrdubblaxar. Den unika specificiteten hos DFHBFSI för parallell G4-struktur möjliggör dynamisk övervakning av topologisk växling av G4 i realtid, vilket sällan undersöks i tidigare forskning om G4-riktade färgämnen.

Detta visade tydligt att RFP-kromoforen är ett smart G4-färgämne som är kompetent att visualisera G4-strukturomkopplare i realtid, vilket är mycket lovande för funktionell undersökning av G4- och G4-baserade DNA-nano-maskiner. Elektrondensitetsanalys tyder på att i detta mycket vridna S1-tillstånd överförs den elektroniska laddningen uppenbarligen från fenolgruppen till imidazolinon, vinylbindning och aromatiska ringdelar Figur 5C. Denna korsning orsakar en tvinnad intramolekylär laddningsöverföring TICT för att underlätta strålningsfri avkoppling och resulterar i en extremt låg oscillatorstyrka f1 på 0.

Denna deaktiveringsväg liknar den som tidigare rapporterats för de gröna och röda fluorescerande proteinkromoforerna 33, 60. En jämviktsgeometriskonfiguration vid den minsta energipunkten för marktillståndet S0SO -min och den minsta energipunkten för exciterat tillstånd S1S 1 min. B Potentiella energiytor av S 1 röd och S 0 blå samt oscillatorstyrka f osc längs den fenoxivridna fotoisomeriseringsvägen.

Positiva isosytor är röda och negativa isosytor är blåa. Tre representativa komplex som startkonformationer simulerades: Sådana vridningsvinklar är mycket nära planaritet och jämförbara med mCherry-kromoforen 13. I y-axeln står 0 för ingen vändning och 1 står för vändning. Vändning definieras som fenoxiringen roterar över planet vinkelrätt mot imidazolringen. Sammantaget resonerade kvantkemisk beräkning och molekylär modellering den fluorogena egenskapen hos DFHBFSI vid G4-bindning och dess unika specificitet för parallell G4.

Uppmuntrad av deras framstående spektrala meriter, inklusive ljusröd luminiscens, stora Stokes-skift, antifotoblekning och tvåfotons fluorescerande egenskaper, utnyttjade vi ytterligare DNA-efterlikningar av RFP som fluorescerande sonder för levande cell- och vävnadsbioavbildning.

Före avbildningsexperiment bekräftade vi att den G4-aktiverade fluorescensen av DFHBFSI knappt påverkades av närvaron av celllysat och cellodlingsmedium med eller utan levande celler Kompletterande figur S14. Aptamerer är enkelsträngade DNA- eller RNA-oligonukleotider med unik molekylär igenkänning och bindningsförmåga som är specifika för olika mål, inklusive små molekyler, proteiner och levande celler 65-67.

En hög överlappningskoefficient 0. Däremot förlorade EGFP snabbt sin fluorescens i 10 min bestrålning på grund av allvarlig fotoblekning. Vidare kan realtidsavbildning av en enda levande CCRF-CEM-cell bekräftat att starkt membranfärgning fortfarande kan mätas även efter 2 timmars kontinuerlig observation, vilket möjliggör övervakning av dynamiska processer av membranproteiner, såsom cellulär internalisering av PTK7 Figur 8B. Dessa resultat visade att DNA-efterliknande av RFP: er är lämpliga för långvarig och realtids cellulär avbildning på grund av deras överlägsna anti-fotoblekningsegenskaper.

Bilderna förvärvades med hjälp av 488 nm excitation och presenterades som överlagringsbilder överst från 500 till 550 nm emissionskanalgrön respektive 570—620 nm emissionskanalröd, skalningsfält: Samlokaliseringsanalys av röda och gröna fluorescenskanaler i övre bilder botten . Båda RMFP: erna uppvisar stor styrka för cellspecifik avbildning baserat på skillnader i måluttryck Kompletterande figurer S16 och S17, som effektivt kan diskriminera inriktning på antigen-positiva celler från negativa celler.

(с) 2019 cermo-lit.ru